酶标仪（用于酶联免疫吸附试验等的光度检测设备）的校准需围绕“光学检测准确性”“仪器稳定性”“板孔一致性”核心，确保吸光度测量可靠（吸光度偏差直接影响实验结果，如定性判断“阴/阳性”或定量计算浓度）。以下是关键校准参数及依据（参考《酶标仪校准规范》及行业实践）：

一、核心必校参数（影响检测准确性的关键）

1. 吸光度示值误差（最核心参数）

• 定义：酶标仪测量标准吸光度溶液的示值与标准值的偏差（如标准溶液吸光度1.000A，仪器显示0.980A，误差-0.020A）。

• 校准原因：吸光度是实验结果的直接数据（如通过吸光度计算抗原浓度），示值误差会导致定量结果偏差（误差0.05A可能导致浓度计算偏差10%-20%）。

• 校准方法：

• 0-1.0A范围：误差≤±0.015A；

• 1.0-2.0A范围：误差≤±0.030A（高吸光度段允许稍大偏差）。

1. 标准品：使用经计量认证的吸光度标准溶液（通常为6个浓度点，覆盖0-2.0A，如0.000A、0.200A、0.500A、1.000A、1.500A、2.000A，波长涵盖450nm、492nm等常用波长）；

2. 操作：将标准溶液注入酶标板（每孔200μL），在对应波长下测量（每个点测3次，取平均值）；

3. 计算误差：误差=仪器示值-标准值；

4. 合格标准：RSD≤1.0%（0-1.0A）；RSD≤2.0%（1.0-2.0A）
   

2. 吸光度重复性（稳定性校准）

• 定义：同一标准溶液在相同条件下多次测量的一致性（如对1.000A标准液测6次，示值在0.995-1.005A，极差0.010A）。

• 校准原因：重复性差会导致同一样品多次测量结果波动（如临床检测中，同一样本两次测量吸光度差0.03A，可能误判为“阳性/阴性”）。

• 校准方法：

1. 选择中高吸光度标准溶液（如0.500A、1.000A）；

2. 同一孔连续测量6次（或同一浓度3个平行孔各测2次）；

3. 计算：相对标准偏差（RSD）=（标准差/平均值）×100%；

4. 合格标准：RSD≤1.0%（0-1.0A）；RSD≤2.0%（1.0-2.0A）。

3. 波长示值误差与重复性（光学基础校准）

• 定义：
  

• 波长示值误差：仪器显示波长与实际输出波长的偏差（如显示450nm，实际452nm，误差+2nm）；

• 波长重复性：多次测量同一波长的波动（如450nm测量3次，结果449.8-450.2nm，波动0.4nm）。

• 校准原因：酶标实验对波长敏感（如450nm为目标波长，若实际用460nm，吸光度可能下降20%），波长不准会导致检测灵敏度下降。

• 校准方法：

• 波长示值误差：≤±2nm（可见光区400-700nm）；

• 波长重复性：≤1nm。

1. 标准品：使用汞灯、氘灯或标准滤光片（如钬玻璃滤光片，已知特征吸收峰波长）；

2. 扫描特征吸收峰（如钬玻璃在536nm有吸收峰），记录仪器显示的峰值波长；

3. 误差计算：误差=显示波长-标准波长；

4. 合格标准：
   

   波长示值误差：≤±2nm（可见光区400-700nm）；

   波长重复性：≤1nm。

4. 板孔间差异（多通道一致性校准）

• 定义：酶标仪测量同一标准溶液在不同板孔（如1-96孔）的吸光度差异（如1号孔0.500A，96号孔0.520A，差异0.020A）。

• 校准原因：板孔间差异大（如通道间光路不一致）会导致同一样品在不同孔的检测结果偏差（如96孔板实验中，边缘孔与中心孔结果不可比）。

• 校准方法：

1. 向96孔板所有孔注入同一浓度标准溶液（如0.500A），避免气泡、液面不平等干扰；

2. 测量所有孔吸光度，记录最大值（A max）和最小值（A min）；

3. 计算：板间差=A max - A min；

4. 合格标准：板间差≤±0.020A（0.5A附近）。

二、辅助校准参数（影响稳定性与可靠性）

1. 基线漂移（长期稳定性）

• 定义：无样品时（空板或空气），吸光度随时间的变化（如0小时0.000A，2小时0.005A，漂移0.005A）。

• 校准原因：基线漂移会导致空白值升高（如空白孔吸光度从0.000A升至0.010A，样品吸光度需减去更高空白值，误差增大）。

• 校准方法：

1. 仪器预热30分钟后，测量空板吸光度（450nm）；

2. 保持仪器运行，2小时后再次测量同一空板；

3. 合格标准：漂移≤0.005A/2小时。

2. 线性误差（定量检测必需）

• 定义：仪器测量系列浓度标准溶液的吸光度与理论线性的偏差（如浓度与吸光度应呈线性，若实际偏离，定量计算会失真）。

• 校准方法：
  

1. 使用3个以上浓度的标准溶液（如0.2、0.5、1.0、1.5A），测量吸光度；

2. 用最小二乘法计算理论线性方程，对比实际值与理论值；

3. 合格标准：线性相关系数R²≥0.995（0-2.0A）。

3. 杂散光（高吸光度段准确性）

• 定义：仪器在某波长下的非目标波长光线比例（如700nm杂散光进入450nm光路，导致高吸光度测量偏低）。

• 校准方法：
  

1. 使用杂散光标准滤光片（如硫酸铜溶液在600nm以上几乎不透光）；

2. 测量滤光片在600nm的吸光度（理论应≥3.0A）；

3. 合格标准：杂散光导致的吸光度下降≤0.3A（即实测≥2.7A）。

三、校准周期与合格判定

1. 校准周期

• 常规使用（如每天1-2次实验）：每年1次；

• 高频使用（如每天≥5次）或用于定量检测（如临床诊断）：6个月1次；

• 维修后（更换光源、单色器）：立即校准。

2. 判定原则

• 核心参数（吸光度示值误差、波长误差、板孔差异）必须全部合格；

• 辅助参数（基线漂移、线性）若不达标，需维修后重新校准；

• 不合格设备需停用，维修合格后方可使用（禁止“超差使用”导致实验数据无效）。

总结

酶标仪校准以“吸光度准确、波长精准、板孔一致”为核心，必校参数包括吸光度示值误差、波长误差、板孔间差异、吸光度重复性，辅助校准基线漂移、线性等。校准需使用经认证的标准品（如吸光度标准液、标准滤光片），确保结果可溯源至国家基准。只有参数全部达标，才能保证酶联免疫等实验的定性/定量结果可靠（如避免假阴性、假阳性或浓度计算偏差）。