酶标分析仪的吸光度示值误差校准是确保检测准确性的核心（吸光度偏差直接影响定性/定量结果，如ELISA实验中阴阳性判断或浓度计算），需通过“标准吸光度溶液+规范测量流程”实现。以下是详细校准方法、步骤及判定标准：

一、校准核心原理

吸光度示值误差校准的本质是：用已知准确吸光度的标准溶液（溯源至国家基准）作为“参照物”，对比酶标仪的测量值与标准值，计算偏差（误差=仪器示值-标准值），确保偏差在允许范围内。

核心依据：吸光度（A）遵循朗伯-比尔定律，仪器示值误差需控制在极小范围（如0-1.0A内≤±0.015A），否则会导致定量结果失真（例如：误差0.05A可能导致浓度计算偏差10%-20%）。

二、校准前准备（关键：消除干扰因素）

1. 核心设备与标准品

• 标准吸光度溶液（必须具备计量证书）：
  

• 浓度点要求：覆盖常用吸光度范围（推荐5-6个点），如：0.000A（空白）、0.200A、0.500A、1.000A、1.500A、2.000A（覆盖酶标仪常用量程0-2.0A）；

• 稳定性：溶液需在有效期内（通常6个月），无沉淀、气泡（使用前颠倒混匀，避免阳光直射）。

• 配套工具：
  

• 标准96孔酶标板（聚苯乙烯材质，透光性一致，无划痕、变形—— 板孔透光差异会导致测量误差）；

• 移液枪（精度10μL级，确保每孔加液体积一致，±1μL以内，避免液面高度不同影响吸光度）；

• 无绒布（清洁酶标板底部，去除指纹、水渍—— 污渍会导致吸光度偏高0.01-0.03A）。

2. 仪器与环境准备

• 仪器预热：开机预热30分钟（确保光源、检测器稳定—— 预热不足会导致示值漂移，尤其是1.0A以上高吸光度点）；

• 波长选择：校准实验常用波长（如450nm、492nm，按实际使用场景选择，至少覆盖1个常用波长）；

• 环境控制：
  

• 温度25±2℃（温度变化会影响溶液吸光度，每变化1℃可能导致0.001A偏差）；

• 避免强光直射（会干扰检测器，导致示值跳变）；

• 关闭通风橱、风扇（避免气流导致酶标板振动）。

三、详细校准步骤（以450nm波长、0-2.0A量程为例）

1. 标准溶液加注（确保板孔一致性）

1. 向96孔板中选择3列（如A、B、C列）作为平行组，每列对应1个标准浓度（减少板间差异影响）；

2. 用移液枪向每孔加注200μL标准溶液（如A列加0.200A溶液，B列加0.500A溶液，依次类推），注意：
   

• 避免产生气泡（气泡会散射光，导致吸光度偏低0.05A以上，需用移液枪尖刺破气泡）；

• 液面高度一致（差1mm可能导致0.005A偏差，加注后目视检查液面）；

3. 室温静置10分钟（让溶液温度与环境一致，消除加注时的温度波动）。

2. 吸光度测量（减少随机误差）

1. 将酶标板放入仪器，确保定位准确（板边缘与定位槽对齐，避免斜放导致光路偏移）；

2. 选择“单波长测量”（450nm），设置测量模式为“全部孔”，启动测量；

3. 每块板重复测量3次（每次测量前用无绒布轻擦板底，去除冷凝水），记录每孔吸光度值（如A1孔第一次0.201A，第二次0.199A，第三次0.200A）。

3. 数据计算（核心：误差与重复性）

1. 计算平均值：
   

• 每浓度点取3列×3次测量的平均值（如0.200A标准溶液，18个数据的平均值为0.202A）；

2. 计算示值误差：
   

• 误差=测量平均值 - 标准值（如0.202A - 0.200A = +0.002A）；

3. 计算重复性（同浓度内偏差）：
   

• 同一浓度点18个数据的标准差（SD）需≤0.005A（确保测量稳定）。

四、合格判定标准（按精度等级）

根据《酶标仪校准规范》及行业要求，吸光度示值误差需满足：

| 吸光度范围（A） | 普通酶标仪（临床常规） | 精密酶标仪（科研定量） | 关键影响（超标后果）                                                                 |
|-----------------|------------------------|------------------------|--------------------------------------------------------------------------------------|
| 0.000-1.000     | ≤±0.020A               | ≤±0.010A               | 误差0.03A会导致定量浓度偏差10%以上（如实际浓度10ng/mL，计算为11ng/mL）                |
| 1.001-2.000     | ≤±0.030A               | ≤±0.020A               | 高吸光度段误差过大会导致“平台效应”误判（如实际未达检测上限，却显示已饱和）              |

示例：0.500A标准溶液，普通酶标仪测量值0.485A（误差-0.015A）→ 合格；若测量值0.470A（误差-0.030A）→ 不合格，需维修。

五、误差超标的常见原因及排除

若校准发现误差超标，按以下步骤排查（优先排除操作因素）：

| 可能原因                 | 排查方法                                                                 | 解决措施                                                                 |
|--------------------------|--------------------------------------------------------------------------|--------------------------------------------------------------------------|
| 标准溶液变质/浓度不准    | 用新开封的标准溶液重新测量，对比结果                                     | 更换在有效期内的标准溶液（确保有计量证书）                               |
| 酶标板透光性差/有划痕    | 更换新的标准酶标板，测量同一溶液                                         | 使用无划痕、透光一致的板（推荐品牌：Costar、Nunc等）                     |
| 板孔有气泡/液面不平      | 目视检查板孔，用移液枪尖刺破气泡，确保每孔加液量200±1μL                  | 加注时慢吸慢放，避免气泡；用校准过的移液枪（每年校准1次）                 |
| 仪器光源老化（能量不足） | 测量高吸光度点（如2.000A），若示值普遍偏低（如1.900A），检查光源强度     | 更换光源灯（氙灯寿命约2000小时，卤钨灯约5000小时）                       |
| 检测器灵敏度下降         | 测量低吸光度点（如0.200A），示值波动大（SD＞0.008A）                     | 联系厂家清洁或更换检测器（光电二极管老化需更换）                         |

六、校准周期与日常维护

• 校准周期：
  

• 普通酶标仪：每年1次（法定外校）+ 每3个月1次内校（用自备标准溶液）；

• 精密酶标仪：每6个月1次（法定外校）+ 每月1次内校。

• 日常维护：
  

• 每次使用后清洁读数窗口（用无绒布蘸乙醇擦拭，去除样品残留）；

• 避免测量有色溶液（如血红蛋白）直接接触板孔（会污染光路）；

• 长期不用时，每月开机30分钟（防止光源受潮）。

总结

吸光度示值误差校准的核心是“用标准溶液验证仪器测量准确性”，关键在于：标准溶液的可靠性（溯源性）、操作的一致性（加液、板孔状态）、环境的稳定性（温度、光线）。校准不仅是满足法规要求，更是保证实验数据可靠的基础—— 尤其是定量实验（如药物浓度检测），吸光度误差0.01A就可能影响最终结论，必须严格执行。