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紫外可见分光光度计需要校准哪些参数?

日期:2025-07-28 16:44 | 人气:28

紫外可见分光光度计(UV-Vis)的校准需围绕“光学性能”“测量准确性”“仪器稳定性”三大核心,确保吸光度、波长等关键参数可靠(直接影响定性分析(如物质鉴别)和定量分析(如浓度计算)结果)。以下是必校参数、校准方法及依据(参考JJG 178-2021《紫外、可见、近红外分光光度计检定规程》):

一、必校核心参数(直接影响测量准确性)

1. 波长示值误差与重复性(光学基础参数)

  • 定义

    • 波长示值误差:仪器显示波长与实际输出波长的偏差(如显示260nm,实际262nm,误差+2nm);

    • 波长重复性:多次测量同一波长的波动范围(如260nm测量3次,结果259.8-260.2nm,波动0.4nm)。

  • 校准原因:物质的吸收峰波长是定性依据(如DNA在260nm有特征峰),波长偏差会导致“吸收峰错位”(如误判物质种类),或吸光度测量值偏低(偏离峰位)。

  • 校准方法

    • 紫外区(200-400nm):误差≤±1.0nm,重复性≤0.5nm;

    • 可见区(400-780nm):误差≤±2.0nm,重复性≤1.0nm。

    • 误差=显示波长-标准波长;

    • 重复性=3次测量的最大值-最小值;

    1. 标准物质:使用钬玻璃滤光片(紫外区241.13nm、278.15nm;可见区536.33nm等特征峰)或氘灯/汞灯(氘灯216.5nm、253.6nm;汞灯253.65nm、546.07nm);

    2. 操作:扫描特征峰,记录仪器显示的峰值波长(重复3次);

    3. 计算

      误差=显示波长-标准波长;

      重复性=3次测量的最大值-最小值;

    4. 合格标准

      紫外区(200-400nm):误差≤±1.0nm,重复性≤0.5nm;

      可见区(400-780nm):误差≤±2.0nm,重复性≤1.0nm。

2. 吸光度示值误差与重复性(定量核心参数)

  • 定义

    • 吸光度误差:仪器测量标准溶液的吸光度与标准值的偏差(如标准值1.000A,仪器显示0.985A,误差-0.015A);

    • 吸光度重复性:同一溶液多次测量的一致性(如6次测量极差≤0.005A)。

  • 校准原因:吸光度是定量计算的基础(A=εbc),误差会直接导致浓度计算偏差(如误差0.02A,浓度偏差可能达5%)。

  • 校准方法

    1. 标准物质:使用重铬酸钾溶液(紫外区:235nm、257nm、313nm、350nm)或硫酸铜溶液(可见区:630nm),浓度需溯源至国家基准;

    2. 操作:将溶液注入石英比色皿(配对使用,避免比色皿误差),测量3次取平均值,对比标准值;

    3. 合格标准
      | 吸光度范围(A) | 误差允许值   | 重复性允许值 |
      |-----------------|--------------|--------------|
      | 0.1-0.5         | ±0.015A      | ≤0.005A      |
      | 0.5-1.0         | ±0.020A      | ≤0.008A      |
      | 1.0-2.0         | ±0.030A      | ≤0.012A      |

3. 杂散光(高吸光度测量准确性)

  • 定义:非目标波长的光线进入检测器的比例(如测量220nm时,280nm杂散光混入,导致吸光度示值偏低)。

  • 校准原因:杂散光会破坏朗伯-比尔定律线性关系(高浓度时吸光度不随浓度增加而升高),导致定量失效(如实际浓度100μg/mL,计算为80μg/mL)。

  • 校准方法

    • 紫外区(200-340nm):杂散光≤0.1%;

    • 可见区(400-780nm):杂散光≤0.5%。

    • 紫外区(220nm):用1.0g/L亚硝酸钠溶液(理论吸光度≥4.0A,杂散光应≤0.01%);

    • 可见区(600nm):用50g/L硫酸铜溶液(杂散光应≤0.1%);

    1. 标准滤光片/溶液

    2. 操作:测量滤光片/溶液的吸光度,若吸光度≥2.0A(对应杂散光≤0.1%)则合格;

    3. 合格标准

      紫外区(200-340nm):杂散光≤0.1%;

      可见区(400-780nm):杂散光≤0.5%。

二、辅助校准参数(影响稳定性与一致性)

1. 基线平直度(全波长扫描准确性)

  • 定义:无样品时(空白比色皿),全波长范围内吸光度的波动(如200-800nm扫描,吸光度在±0.002A内波动)。

  • 校准原因:基线漂移会导致空白值偏高(如空白吸光度0.010A,样品测量时需减去该值,引入误差)。

  • 校准方法

    1. 用空气或空白溶液(与样品溶剂一致)作为参比,扫描200-800nm波长;

    2. 记录最大波动值(峰-谷差);

    3. 合格标准:紫外区≤±0.004A,可见区≤±0.002A。

2. 比色皿配套性(消除容器误差)

  • 定义:同一规格比色皿之间的吸光度差异(如2个1cm石英皿,测量同一溶液的吸光度差0.008A)。

  • 校准原因:比色皿差异会导致平行样测量偏差(如同一批样品,用不同皿测量结果不可比)。

  • 校准方法

    1. 取4-6个同规格比色皿,注入纯溶剂(如蒸馏水);

    2. 以其中一个为参比,测量其他皿的吸光度;

    3. 合格标准:吸光度差≤0.005A(超出需标记配对使用)。

3. 基线漂移(长期稳定性)

  • 定义:基线随时间的变化(如0小时基线0.000A,1小时后0.005A,漂移0.005A/h)。

  • 校准原因:漂移会导致长时间实验(如动力学分析)的结果偏差(如反应速率计算错误)。

  • 校准方法

    1. 以空气为参比,在257nm(紫外)或630nm(可见)波长下,连续监测1小时;

    2. 合格标准:漂移≤0.002A/h(紫外区)、≤0.001A/h(可见区)。

三、校准周期与注意事项

1. 校准周期

  • 常规使用(每天1-2次):每年1次(法定外校) + 每3个月1次内校(用自备标准溶液);

  • 高频使用(每天≥5次)或用于法定检测(如药品检验):每6个月1次(法定外校)

  • 维修后(更换光源、单色器、检测器):立即校准

2. 关键注意事项

  • 比色皿影响:必须使用石英比色皿(紫外区)或玻璃比色皿(可见区),使用前清洁外壁(指纹会导致0.01-0.03A误差);

  • 光源预热:开机后需预热30分钟(紫外区用氙灯/氘灯,可见区用卤钨灯),确保光源稳定;

  • 环境控制:温度20±2℃(避免温度波动导致溶液吸光度变化),湿度45%-65%(防止光学部件受潮)。

总结

紫外可见分光光度计的校准以“波长准确、吸光度可靠、杂散光低”为核心,必校参数包括波长误差、吸光度误差、杂散光,辅助校准比色皿配套性、基线漂移等。校准需使用溯源性标准物质(如重铬酸钾溶液、钬玻璃),严格控制操作和环境因素。只有参数全部达标,才能保证定性分析(如物质鉴别)的峰位准确和定量分析(如浓度计算)的结果可靠。


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紫外可见分光光度计